冯程
免疫组织化学和激光共聚焦扫描显微镜冰冻组织冰冻切片(10米厚)被放置在明胶涂层幻灯片和培养15分钟。
100甘氨酸和0.1%羧基牛血清白蛋白(奥利昂,瓦赫宁根大学,荷兰)型,PH值7.4。然后冰冻切片孵育过夜的主要对波形蛋白抗体(克隆模式;西格玛,圣路易斯,钼,美国)在潮湿室。灰化后在公共电视网,准备培养生物驴抗抗体其次是streptavidin-cy-2(biotrend,科隆,德国)。细胞核染色与0.002%7-aminoactinomycin丁(分子探针,卡尔斯巴德,加利福尼亚州,美国)。遗漏的主要抗体作为阴性对照。该immunolabelled切片检查与tcn-nt徕卡激光显微镜,配备氩氪和氦氖激光。系列共聚焦部分采取了通过深入的组织样本在0.5 -米间隔。为了提高图像质量和获得高信噪比每个图像从一系列信号平均。经过数据采集,图像被转移到一个硅谷图形工作站印或辛烷值(硅谷图形公司,桑尼维尔,加利福尼亚州,美国)的图像恢复和重建使用imaris,多通道图像处理软件(平面,与ü丰富,瑞士)。该方法的原理和许多图像获得这一技术已先前公布的[ 46,47 ]。在标记的实验中,冰冻切片孵育过夜的原发性多克隆抗体(抗c - kit,丹麦,丹麦)驴抗兔抗体之后,加上接触件(dianova,汉堡,德国)。经过反复冲洗,硫化铅,准备孵育antivimentin抗体直接耦合与Cy 3。肌原纤维染色的F -肌动蛋白与灼633-conjugated鬼笔环肽。细胞核染色与4,6-diamidino-2-phenylindole(吲哚)(分子探针)。所有的准备工作都安装在mowiol(赫斯特,法兰克福,德国)。经典的免疫细胞化学进行fomalin-fixed,石蜡切片中的卵白素一生物素过氧化物酶复合物的方法,如以前所报告[ 10]。主要是:CD 34单克隆抗体用于–:100,1,10(biogenex克隆qbend,圣拉蒙,加利福尼亚州,美国)和波形蛋白,单克隆,1 :100,克隆v-9(biogenex)。
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